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CHO/NPC1(-) & NPC1 knock in cells

CHOwt: retrovirus-mediated gene trap のためにCHO-K1にretrovirus receptor (CAT1)を安定発現させた細胞。wtというのはNPC1のgenotypeがwtという意味。puromycin耐性。

CHO/NPC1(-): 上記細胞のNPC1 locusをgene trapでつぶしたもの。puromycin/neomycin に耐性。Trap vector にはneo^rおよびlacZがのっていて、これらがNPC1のendogenous promoter でドライブされている。

CHO/NPC1 knock in: CHO/NPC1(-) に Flag-NPC1 (human)を安定発現させたもの。puromycin/neomycin/blasticidinに耐性。

薬物耐性およびLacZの発現

	puromycin	G418	blasticidin	LacZ
wt	○	Ｘ	Ｘ	Ｘ
NPC1(-)	○	○	Ｘ	○
knock in	○	○	○	○

○耐性またはpositive,Ｘ非耐性またはnegative

NPC1の発現

	Hamster NPC1 (内因性)	human NPC1 (外因性)
wt	○	Ｘ
NPC1(-)	Ｘ	Ｘ
knock in	Ｘ	○

各々Westernで検出可能、方法は下記参照

フェノタイプ

	コレステロール蓄積(filipin staining)	Filipin/theta-toxinの毒性に対する感受性
wt	Ｘ	高い
NPC1(-)	○	低い
knock in	Ｘ	高い

NPC1(-)細胞（左）では核周囲にフィリピン染色陽性の小胞が蓄積する。正常細胞（右）では、細胞膜がフィリピンで染まる。

NPC1(-)細胞と Flag-NPC1 knock in 細胞を混ぜて培養した。抗Flag抗体で染まらないNPC1(-)細胞では、フィリピンで細胞内小胞が染まる。

Tips for cell culture

F12/10%BCSで維持、抗生物質は入れない。血清について、私たちは「NPC細胞が確実にフィリピンで染まる」血清をロットチェックして購入しています。そうでない血清を使った場合、フィリピン染色による区別が難しくなる可能性がありますが、維持するだけならどんな血清でも大丈夫だと思います。

Tips for Western blotting of endogenous NPC1

NPC1はheat-labile。普通sample bufferで100度で煮込むところを65度15分にして、PAGEはcold roomで流す。
detergentで細胞から溶出したextractsではきれいに出ない。100,000g membrane preparationからsample buffer で溶出するのがベスト。ヒトNPC1については、ZymedのモノクロのほうがSanta Cruzのポリクロよりきれいだが、Zymedのモノクロはマウス、ハムスターとクロスしない。ヒト細胞、CHOともに170kDaと200kDaの２本のバンドが出る。

Tips for Western blotting of Flag-NPC1 (expressed in CHO cells)

同上、100度で煮込むとbandがきれいになくなります。
1% TritonX-100, 0.5% CHAPS, 1% NP-40など、たいていのdetergentで細胞から溶出できる。そのまま流してもanti-Flagで検出できるが、ノンスペの多い汚いブロットになる。100,000g membrane preparationを使う、または、anti-Flag M2 agarose で落としてポリクロのanti-Flagでブロットするときれい。Overexpressionのため、170-200kDaのbroad bandになる。

Higaki, K., Ninomiya, H., Sugimoto, Y., Suzuki, T., Taniguchi, M., Niwa, H., Pentchev, P.G., Vanier, M.T. & Ohno, K. (2001) Isolation of NPC1-deficient Chinese hamster ovary cell mutants by gene trap mutagenesis. J. Biochem. 129, 875-880. [Pubmed]

Sugimoto Y, Ninomiya H, Ohsaki Y, Higaki K, Davies JP, Ioannou YA and Ohno K (2001) Accumulation of cholera toxin and GM1 ganglioside in the early endosome of Niemann-Pick C1-deficient cells. Proc. Natl. Acad. USA 98, 12391-12396. [Pubmed]