組織分布

NPC1-L1の場合、組織特異性が機能に直結している。ヒトとマウスのいずれでも、小腸で発現が高い。マウスを用いた解析によれば、小腸のなかでもその発現は均一ではない。mRNA、タンパク質のレベルはともに十二指腸、空腸で高く、回腸で低い。食事中のコレステロールは主に十二指腸、空腸で吸収されるが、NPC1-L1の分布はこれをうまく説明できる。

注意すべき点として、ヒトとマウスでは肝臓での発現レベルが明らかに違う。ヒトでは、肝臓でも小腸と同等かそれ以上に発現が高いのに対して、マウスでは、肝での発現は低い。

免疫組織染色では、細胞内での局在も観察されている。小腸では上皮細胞のapical側に局在している。この局在は、NPC1-L1が小腸腔内のコレステロールの吸収に直接関わることを示唆する。肝細胞ではbile canaliculiに局在している。この局在は、NPC1-L1が胆管腔内に排出されたコレステロールの再吸収に関わることを示唆する。

Sane AT, Sinnett D, Delvin E, Bendayan M, Marcil V, Menard D, Beaulieu JF, Levy E. (2006) Localization and role of NPC1L1 in cholesterol absorption in human intestine. J Lipid Res. 47, 2112-2120. [Pubmed]

Temel R.E., Tang W., Ma Y., Rudel L.L., Willingham M.C., Ioannou Y.A., Davies J.P., Nilsson L.M. & Yu L. (2007) Hepatic Niemann-Pick C1-like 1 regulates biliary cholesterol concentration and is a target of ezetimibe. J. Clin. Invest. 117, 1968-1978. [Pubmed]

コレステロールの腸肝循環でのNPC1-L1（赤丸）の機能

消化管からの吸収（小腸上皮apical側）、胆管からの吸収(肝細胞basolateral側)を行う。ABCG5/G8ヘテロダイマー(青丸)は逆向きのフローに必要。黄色は食物中のコレステロール・胆汁酸ミセル・カイロミクロン。

細胞内局在とコレステロール輸送/培養細胞の発現系でのデータ

培養細胞での細胞内局在については、当初お互いに相容れない報告がなされた。まず、Shering-PlougのDr. Altmannのグループの報告(1)では、NPC1-L1は細胞表面に局在した。彼らはFlag-tagged NPC1-L1のCHO安定発現株を作製したのだが、そのセレクションに抗Flag抗体によるflow cytometry を用いており、細胞表面に存在するのは当然の結果である。次に、Mount Sinai のDr. Ioannou のグループの報告(2)では、NPC1-L1はNPC1と同様に細胞内小胞に存在した。これは、HepG2細胞での内因性NPC1-L1の染物、およびCOS細胞でのNPC1-L1-YFP fusion proteinの発現実験の結果である。この小胞はRab5-positive/lamp2-negativeであり、early endosome ないしこれから出るrecycling endosomeに存在することが示唆された。われわれもHepG2細胞を市販の抗体で染めてみたが、細胞内小胞が染まった。

その後、NPC1-L1は細胞表面と細胞内小胞を行き来しており、それが細胞のコレステロール濃度でコントロールされることが報告された(3)。このペーパーでは、ラットの肝癌由来の培養細胞 (MacArdle RH7777) にFlagまたはYFPで標識したNPC1-L1を発現させている。高コレステロール状態ではNPC1-L1は細胞内小胞に局在し、低コレステロール状態では細胞表面に存在した。NPC1-L1を含む細胞内小胞はtransferrin-positive であり、recycling endosome であると考えられた。また、NPC1-L1が細胞表面にあるとき、細胞のコレステロール取り込みが増加した。この実験では、エタノールに溶かした[¹⁴C]cholesterol をPBS/1.5%BSAで30倍に希釈してそのまま投与している。つまり、LDL由来のコレステロールの取り込みではなく、可溶性のコレステロールの取り込みを見ている。

Endosome/lysosome へのtargeting motif を持たないNPC1-L1が細胞表面に出て、さらにrecycling endosome との間を行ったり来たりするというのはごく自然である。このフローが細胞のコレステロール濃度でコントロールされるとき、次のように問題を設定することができる。

1. どこのコレステロール濃度に依存しているのか。Plasma membrane and/or endosome
2. どのようにコントロールされているのか。Plasma membraneのコレステロール濃度に依存するという仮定のもとで、低コレステロールで細胞表面からのinternalizationがとまる、または高コレステロールでendosome への輸送が亢進する、のいずれかが考えられる。実験データはないのだが、細胞内へのコレステロールの取り込みという機能から予想すると、NPC1-L1の局在はplasma membraneのコレステロール濃度依存性にコントロールされていて、低い時にはそこに止まっている（コレステロールがやってくるのを待っている）というシナリオが最も受け入れ易い。

(1) Iyer, S.P., Yao, X., Crona, J.H., Hoos, L.M., Tetzloff, G., Davis, H.R. Jr, Graziano, M.P., & Altmann S.W. (2005) Characterization of the putative native and recombinant rat sterol transporter Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1) protein. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 282-292. [Pubmed]

(2) Davies, J.P., Scott, C., Oishi, K., Liapis, A., & Ioannou, Y.A. (2005) Inactivation of NPC1L1 causes multiple lipid transport defects and protects against diet-induced hypercholesterolemia. J. Biol. Chem. 280, 12710-12720. [Pubmed]

(3) Yu, L., Bharadwaj, S., Brown, J.M., Ma, Y., Du, W., Davis, M.A., Michaely, P., Liu, P., Willingham, M.C., & Rudel, L.L. (2006) Cholesterol-regulated translocation of Niemann-pick C1-like 1 to the cell surface facilitates free cholesterol uptake. J. Biol. Chem. 281, 6616-6624. [Pubmed]

上海のSongのグループは、上記のYu et al.とほとんど同じ方法でNPC1-L1の細胞内での動きを解析し、コレステロール依存性のNPC1-L1のinternalization にはclathrin/AP2 complex が必要であること、ezetimibeはNPC1-L1のinternalization を阻害することを示した(4)。デンマークのグループは、同じような内容に加えて、HepG2細胞ではインスリン処理によりNPC1-L1が細胞表面に移動することを報告している(5)。これらの報告では、NPC1-L1が細胞内を｢動く」ことがコレステロールトランスポートに必須であることが強調されている。この蛋白質が単なるトランスポーターなら、ABC蛋白質と同じように、局所の膜にとどまったまま働けるはずである。NPC1-L1の場合、コレステロールに富む膜ベジクルに乗っていっしょに動くことが必要であるらしい。

(4) Ge L., Wang J., Qi W., Miao H.H., Cao J., Qu Y.X., Li B.L. & Song B.L. (2008) The cholesterol absorption inhibitor ezetimibe acts by blocking the sterol-induced internalization of NPC1L1. Cell Metab. 7, 508-619. [Pubmed]

(5) Petersen N.H., Faergeman N.J., Yu L. & Wustner D. (2008) Kinetic imaging of NPC1L1 and sterol trafficking between plasma membrane and recycling endosomes in hepatoma cells. J. Lipid Res. 49, 2023-2037. [Pubmed]

Songのグループからの続報。NPC1-L1がコレステロールの枯渇に伴いエンドゾーム系から細胞表面に出て行くときに、miosyn Vb, Rab11などがカーゴ複合体を形成する。さらに、GTPase　の一つであるCdc42がスイッチ分子として機能する。

Chu BB, Ge L, Xie C, Zhao Y, Miao HH, Wang J, Li BL, Song BL. (2009) Requirement of myosin Vb.Rab11a.Rab11-FIP2 complex in cholesterol-regulated translocation of NPC1L1 to the cell surface. J Biol Chem. ;284, :22481-22490. [Pubmed]

Xie C, Li N, Chen ZJ, Li BL, Song BL. (2011) The small GTPase Cdc42 interacts with Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1) and controls its movement from endocytic recycling compartment to plasma membrane in a cholesterol dependent manner. J Biol Chem. 2011 Aug 15. [Pubmed]

摘出標本での観察ではあるが、コレステロール濃度依存性の細胞内局在の変化が小腸上皮細胞でも起きていることが報告された。

Skov M, Tonnesen CK, Hansen GH, Danielsen EM. (2011) Dietary cholesterol induces trafficking of intestinal Niemann-Pick Type C1 Like 1 from the brush border to endosomes. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G33-40. [Pubmed]

小腸吸収細胞での機能

NPC1-L1は enterocyte の brush border に、すなわち apical 側の膜に局在している。消化管内のミセルに含まれるコレステロールは、小腸上皮細胞のapical側の膜に取り込まれ、basolateral側にカイロミクロンとして放出される。NPC1-L1はapical側の膜で働くとすると、以下のいずれかのステップで働く可能性が考えられる。

1. ミセルからapical側の膜へのコレステロールの移動。この場合、NPC1-L1はABCタンパク質と同様のトランスポーター活性を持つことになる。
2. Apical側の膜からの内向きの輸送小胞の形成、およびその輸送。

1. の場合、NPC1-L1欠損マウスの小腸上皮細胞のapical側の膜ではコレステロールが枯渇しているはずである。2. の場合、逆にそこではコレステロールが運ばれずに増加しているはずである。上記の培養細胞のデータは 2. のステップで働くことを支持する。

Note. この点に関して、Davisらのペーパー (2) では上皮細胞全体のコレステロール量が低下することが示されている。Apical、basolateral の比較まではされていない。

Note. CaCo-2細胞でコレステロール輸送に対するエゼチマイブの効果をみた実験からは、NPC1-L1がステップ1, 2の両方に働くこと、どちらかというとステップ2の阻害効果のほうが大きいことが報告されている。

Field J.F., Watt K. & Mathur S.N. (2007) Ezetimibe interferes with cholesterol trafficking from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum in CaCo-2 cells. J. Lipid Res. 48, 1735-1745. [Pubmed]

Note. マウスのbrush border から膜小胞を作製しin vitroでコレステロールの取り込みを見てみると、NPC1-L1があってもなくても関係なく取り込まれ、ezetimibeは全く効かなかった。このことは、ステップ1はNPC1-L1に依存しないことを示している。

Knopfel M., Davies J.P., Duong P.T., Kvaerno L., Carreira E.M., Phillips M.C., Ioannou Y.A. & Hauser H. (2007) Multiple plasma membrane receptors but not NPC1L1 mediate high-affinity, ezetimibe-sensitive cholesterol uptake into the intestinal brush border membrane. Biochim. Biophys. Acta. ;1771, 1140-1147. [Pubmed]

Note. Npc1b欠損ハエの腸管上皮細胞ではコレステロールが枯渇している。
NPC1-L1のハエのorthologはNpc1bである。Npc1b欠損の個体はステロール吸収の障害のためlarvaのステージで死んでしまう。その腸管上皮細胞でもコレステロールが枯渇していた。

もうひとつこの論文では不思議なデータが報告されている。Npc1a (mammalian NPC1に相当)欠損の個体では腸管からのコレステロール吸収が亢進していた。ここまではいい、体細胞がコレステロールを利用できない状態にあるとすればそのフィードバックで吸収は亢進するだろう。理解しがたいのは、Npc1a/Npc1bを両方欠損する個体で野生型なみのコレステロール吸収を示したこと。これは、Npc1a欠損によるコレステロール吸収の増加と、Noc1b欠損による低下が相殺しうること、言い換えると、お互いに独立した現象であることを意味する。すなわち、Npc1a欠損によるコレステロール吸収の増加はNpc1bに依存しない。

Voght S.P., Fluegel M.L., Andrews L.A. & Pallanck L.J. (2007) Drosophila NPC1b Promotes an Early Step in Sterol Absorption from the Midgut Epithelium.Cell Metab. 5, 195-205. [Pubmed}

Note.マウス小腸上皮細胞でのコレステロール吸収に、NPC1/NPC2は不要である。
NPC1欠損マウスでは小腸上皮細胞でも遊離型コレステロールの蓄積が証明されるので、この細胞でもNPC1/NPC2がエンドゾーム系からの遊離型コレステロールの排出にかかわることは間違いない。ところが、NPC1欠損マウスで消化管からのコレステロールの吸収試験を行ったところ、wtと比べて変化はなかった 。NPC2欠損マウスでも同様だった。これらの結果は、胆汁酸ミセル由来の遊離型コレステロールの細胞内輸送はNPC1/NPC2に依存しないことを示唆する。

Dixit S.S., Sleat D.E., Stock A.M. & Lobel P. (2007) Do mammalian NPC1 and NPC2 play a role in intestinal cholesterol absorption? Biochem. J. 408, 1-5. [Pubmed]

これらのデータにもとづいて、小腸上皮細胞でのNPC1-L1の機能をもうすこし細かく見てみる。小腸上皮細胞はapical側の膜から胆汁酸ミセルのコレステロールを取り込み、basolateral側にカイロミクロンとして放出する。胆汁酸ミセルではコレステロールはほとんど全て遊離型であるのに対して、カイロミクロンではエステル型である。このトランスポートは、下の図に示すように多数のステップからなる。

1.	胆汁酸ミセルの遊離型コレステロールが小腸上皮細胞のapical側の膜に移行する。このステップはNPC1-L1に依存しない。
2.	Apical側の膜からエンドゾーム系へ遊離型コレステロールが移行する。このステップがNPC1-L1依存性。行き先は (培養細胞のデータからは) endosome/lysozome ではなくて、recycling endozome である。
3.	エンドゾーム系からapical側の膜への遊離型コレステロールの逆行性輸送。このステップはNPC1に依存しない。
4.	エンドゾーム系からERへの遊離型コレステロールの輸送。このステップもNPC1に依存しない。
5.	Apical側の膜からのコレステロールの排出。このトランスポートに必要なのがABCG5/G8ヘテロダイマー。
6.	コレステロールの内因性合成系、HMGCoA reductase など、一連の酵素が必要。
7.	コレステロールのエステル化。ACAT (acylco-enzyme A:cholesterol acyltransferase) による。
8.	エステル型コレステロールをカイロミクロンにパッケージするプロセスで、アポ蛋白が加えられる。

通常の末梢細胞では遊離型コレステロールは endosome/lysosomeで生じる。これを細胞のほかの場所へ運ぶステップ（上図のステップ3, 4 に対応）はNPC1依存性である。それに対して、小腸上皮細胞での輸送 (recycling endosome -> 他の場所）はNPC1に依存しない。

転写レベルでのコントロール

NPC1-L1のプロモーター領域にはSREがある。小腸上皮細胞にコレステロールが負荷されたときの転写レベルでの反応をまとめてみると下の図になる。コレステロールの負荷によりSREBPの活性は低下し、オキシステロールの産生によりLXRの活性は上がる。SREBPの不活化のためNPC1-L1/HMG-CoA Rの転写が低下し、コレステロールの取り込み、合成ともに低下する。LXRの活性化のためABCG5の転写が増加し、コレステロールの排出が亢進する。

Caco-2細胞ではLXR agonist によりNPC1-L1の転写が低下することが報告された。LXRはステップ 2, 5 の両方に効いていることになる。

Duval C., Touche V., Tailleux A., Fruchart J.C., Fievet C., Clavey V., Staels B, & Lestavel S.(2006) Niemann-Pick C1 like 1 gene expression is down-regulated by LXR activators in the intestine. Biochem Biophys Res Commun. 340, 1259-1263. [Pubmed]

NPC1-L1によるトランスポートはコレステロール特異的か？

Sheringのグループによるノックアウトマウスの解析では、NPC1-L1が欠損しても脂肪酸および脂溶性ビタミンの吸収は変化しなかった。また、その阻害薬 ezetimibeをヒトに投与した場合、血中のLDLコレステロールの値は低下するが、トリグリセライドなど他の脂質の濃度はほとんど変化しない。これらのデータは、NPC1-L1がコレステロール輸送に特異的に必要であることを示唆する。

だが、特異的と結論してしまうのは時期尚早かもしれない。東大病院薬剤部のグループは、Caco-2細胞の発現系でNPC1-L1が alpha-tocofenol (vitamin E)の吸収を促進すると報告している(1)。さらに、シンシナティーのグループからの報告によると、マウスではNPC1-L1が飽和脂肪酸の吸収を促進しており、それを阻害することでインスリン抵抗性を抑え、肥満を予防することができるという(2)。これがヒトにもあてはまるなら、ezetimibeは糖尿病と肥満の予防という夢のような効果をもつことになるのだが。残念ながら、ezetimibeを投与されたヒトが痩せたというデータはいまのところないし、NPC1-L1のジェノタイプとBMI (body mass index)の間にも相関は検出されていない。

(1) Narushima K., Takada T., Yamanashi Y. & Suzuki H. (2008) Niemann-pick C1-like 1 mediates alpha-tocopherol transport. Mol. Pharmacol. 74, 42-49. [Pubmed]

(2) Labonte E.D., Camarota L.M., Rojas J.C., Jandacek R.J., Gilham D.E., Davies J.P., Ioannou Y.A., Tso P., Hui D.Y. & Howles P.N. (2008) Reduced absorption of saturated fatty acids and resistance to diet-induced obesity and diabetes by ezetimibe-treated and Npc1l1-/- mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 295, G776-783. [Pubmed]

NPC1-L1とABCG5/G8の共存

ABCG5/G8はNPC1-L1と同じく小腸吸収細胞のapical側に局在し、逆向きのコレステロール輸送、すなわちコレステロールの消化管への排出を担う。その名のとおりへテロダイマーで、ヒトではG5/G8のいずれの欠損も遺伝性高脂血症の原因となる。その高脂血症の特徴として、植物由来のステロール(phytosterol) の血中、組織中濃度が高くなる(sitosterolemia)。ヒトでは肝細胞の bile canaliculiでもこれらふたつの蛋白質が共存している。

一般的に、逆向きの機能をもつ蛋白質を２つ用意して各々の活性を独立に制御すると、より広いレンジでのより素早い調節が可能になる。レンジのほうを考えると、NPC1-L1による足し算とABCG5/G8による引き算の総計としてネットのコレステロール吸収量が決まってくる。スピードのほうについては、主にNPC1-L1で決まっているように思える。上述のように、NPC1-L1はコレステロール依存性に細胞内にはいる。これは分単位の出来事である。これに対して、ABCG5/G8にはそのような速い制御系は知られていない。

もうひとつ、NPC1-L1とABCG5/G8のセットの場合にはステロールの選択という役割がある。食事中にはコレステロールなどの動物性ステロールに加えて植物性のステロールが含まれるが、われわれはこれを利用することができない。NPC1-L1は植物性ステロールの吸収も促進するが(1)、動物性ステロールに比較的選択性が高いとされている。ABCG5/G8は植物性ステロールに選択性が高い。つまり、小腸吸収細胞では、利用できるものを優先的になかに入れておいて、さらに要らないものを選別して捨てるという２重のチェック機構を採用している。NPC1-L1/G5/G8のトリプルノックアウトマウスが高脂血症にならなかったことは(2)、ABCG5/G8が排出する植物性ステロールは主にNPC1-L1によって細胞内にはいってくることを示唆する。ABCG5/G8欠損のヒト高脂血症にはezetimibeが有効であったと報告されている。

(1) Yamanashi Y., Takada T. & Suzuki H. (2007) Niemann-Pick C1-like 1 overexpression facilitates ezetimibe-sensitive cholesterol and beta-sitosterol uptake in CaCo-2 cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 320, 559-564. [Pubmed]

(2) Tang W., Ma Y., Jia .L, Ioannou Y.A., Davies J.P. & Yu L. (2009) Genetic inactivation of NPC1L1 protects against sitosterolemia in mice lacking ABCG5/ABCG8. J. Lipid Res. 50, 293-300. [Pubmed]

NPC1とNPC1-L1によるコレステロール輸送の比較

NPC1とNPC1-L1のホモロジーはアミノ酸レベルで40%程度であり、組織特異性も細胞内での機能も明らかに違う。しかし、ともにコレステロールの輸送を担うという共通点に注目すると、哺乳動物細胞によるこの脂質の扱い方が見えてくる。

生体内ではコレステロールは遊離型かエステル型のいずれかの形をとる。ステロール骨格の3位が水酸基なのが遊離型、ここに脂肪酸が結合するとエステル型。化学的な特性として、遊離型は親水性の部分と疎水性の部分を持ち両親媒性 amphiphilicであるのに対して、エステル型は疎水性である。遊離型は両親媒性のため常に膜に存在する、すなわち２次元の平面に存在するのに対して、エステル型は三次元の集合体をつくることができる。生化学的には、遊離型が生体膜の成分およびステロイドホルモン、胆汁酸などの原料となるのに対して、エステル型は貯蔵、輸送のための分子だと考えられている。細胞内の脂肪滴のなか、および血液、リンパ液のリポ蛋白質ミセルのなかにはエステル型が詰まっている。

NPC1のほうから考えてみると、LDLにより末梢細胞に供給されるコレステロールはエステル型であり、細胞はこれを遊離型にして利用するためにendosome/lysosome系で加水分解する。このとき、三次元にパッケージされた分子が２次元の平面に展開するから大量の膜が必要になる。Endosome/lysosome系では、小胞内に多重膜構造 MVB: multivesicular body を形成することで膜を供給している。NPC1はMVBには存在しない。小胞の限界膜 limiting membraneに局在する。MVBに含まれるコレステロールを限界膜のNPC1に橋渡しするためにNPC2が必要である。

NPC1-L1の場合はどうか。食物中のコレステロールはほとんどエステル型だが、これは消化管内のリパーゼによって分解されるので、胆汁酸ミセルの一部として小腸吸収細胞に到達するときには遊離型になっている。これが小腸吸収細胞のapical側の膜にはいる。ここでは、微絨毛 microvilli を形成することにより大量の膜が用意されている。NPC1-L1は遊離型のコレステロールがはいってくるその場所、apical側の膜に局在している。従ってこの場合、NPC2のような橋渡し蛋白質は不要である。

last updated Oct 2011